Desarrollo en campo de Swietenia macrophylla King propagada in vitro: evaluación comparativa con propagación convencional

Área de estudio

La investigación se desarrolló en la Estación Experimental Agro-Forestal Placetas, situada en la finca Victoria, dentro del poblado de Oliver, al oeste del municipio Placetas, provincia de Villa Clara, Cuba. La zona presenta un clima tropical húmedo de sabana, con un régimen de lluvias más intenso entre mayo y agosto, aunque en años recientes se han registrado variaciones climáticas significativas. La topografía es predominantemente llana, con una precipitación media anual de 1200 mm, una temperatura promedio de 25,1 °C, una humedad relativa del 82 % y una pendiente promedio del 5 %.

El suelo predominante corresponde al tipo Pardo sialítico mullido. El horizonte A exhibe una estructura nuciforme granular, con una saturación por bases igual o superior al 50 % y un espesor de 10 cm. Por su parte, el horizonte B presenta un contenido de arcilla igual o inferior al del horizonte A, una capacidad de intercambio catiónico mayor a 30 cmol⁺ Kg⁻¹ de arcilla y un contenido de hierro libre menor al 3 %. Además, la relación hierro libre/hierro total es inferior al 40 %, con predominio de minerales tipo 2:1 en la fracción arcillosa, lo que genera agregados gruesos y estables.

Procedimiento experimental

Las plantas de Swietenia macrophylla King utilizadas en el estudio provinieron de semillas extraídas de frutos de un árbol identificado en la Estación Experimental Agro-Forestal Placetas, según consta en el expediente botánico correspondiente. Se trabajó con dos tipos de material vegetal: plantas propagadas in vitro mediante embriogénesis somática a partir de embriones cigóticos inmaduros, según el protocolo de Collado et al. (2024)Collado, R., González, S., León, Y., & Menéndez, S. (2024). Embriogénesis somática directa en Swietenia macrophylla King. Biotecnología Vegetal, 24(1), 67-75., y plantas propagadas de forma convencional a partir de semillas germinadas directamente.

Los clones de plantas propagadas in vitro se distribuyeron aleatoriamente en el terreno. Cada clon estuvo representado por 25 individuos, los cuales se sembraron con un espaciamiento de 3 × 3 metros. Se evaluaron descriptores morfológicos como la altura de la planta (medida desde el cuello de la raíz hasta la yema apical con cinta métrica), el diámetro del tallo (registrado a 15 cm del cuello de la raíz mediante un pie de rey), el número de tallos y la cantidad de plantas supervivientes.

Las plantas propagadas in vitro se identificaron con etiquetas plásticas amarillas. En total, se plantaron 467 individuos de propagación convencional y 31 de propagación in vitro, cubriendo un área de 0,65 ha, lo que sumó un total de 498 plantas evaluadas.

Actividades de manejo

Antes y después de la plantación, se realizaron diversas labores de preparación y mantenimiento. Estas incluyeron la instalación de un cerco perimetral con piña, la limpieza y chapea del área, y la recepción de las posturas. Además, se efectuó la roturación y surcado del terreno, junto con el marcaje y preparación de los hoyos de plantación.

Posteriormente, se aplicó materia orgánica en dos etapas distintas para enriquecer el suelo. Finalmente, se llevó a cabo la plantación de los individuos, seguida de actividades de mantenimiento como ruedos y guataqueo para asegurar el establecimiento adecuado de las plantas.

Diseño experimental

Se empleó un diseño de medidas repetidas con dos grupos experimentales: plantas propagadas in vitro y plantas propagadas de manera convencional. Para cada grupo se seleccionaron aleatoriamente 25 individuos, lo que resultó en una muestra total de 50 plantas, equivalente al 7 % de la población total. Las evaluaciones se llevaron a cabo en cinco momentos distintos durante el estudio.

A los 3 meses se realizó la identificación de las plantas, el conteo de supervivencia y el cálculo del área plantada. A los 4 meses se repitió el conteo de supervivencia y se midieron la altura, el diámetro y el número de tallos. Estas mismas mediciones se repitieron a los 8 meses.

A los 12 meses se registró nuevamente la supervivencia y se evaluaron las características morfológicas. Finalmente, a los 14 meses se contabilizaron las plantas muertas y se determinó el área lograda.

Análisis estadístico

En primer lugar, se verificaron los supuestos de normalidad de los residuos mediante la prueba de Shapiro & Wilk (1965)Shapiro, S. S., & Wilk, M. B. (1965). An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika, 52(3-4), 591-611. y la homogeneidad de varianzas con el test de Levene (1960)Levene, H. (1960). Robust Tests of Homogeneity of Variance. Contributions to Probability and Statistics; Stanford University Press: Stanford, CA, USA, 278-292.. Dado que no se cumplieron estos supuestos, se optó por utilizar análisis no paramétricos. Para las variables de altura y diámetro del tallo, se aplicó la metodología descrita por Gómez et al. (2019)Gómez, S., Torres, V., García, Y., Herrera, M., Medina, Y., & Rodríguez, R. (2019). Statistical procedure for the analysis of experiments with repeated measures over time in the agricultural and livestock field. Cuban Journal of Agricultural Science, 53(4), 353-360..

La correlación de Pearson permitió confirmar la asociación entre las mediciones realizadas en diferentes tiempos dentro de la misma unidad experimental. Además, se evaluó el supuesto de esfericidad mediante el estadístico de Mauchly (Pérez & Medrano, 2010Pérez, E. R., & Medrano, L. A. (2010). Análisis factorial exploratorio: Bases conceptuales y metodológicas. Revista Argentina de Ciencias del Comportamiento (RACC), 2(1), 58-66.; Acosta-Amaya & Sánchez Escudero, 2015Acosta-Amaya, M. M., & Sánchez Escudero, J. P. (2015). Desempeño psicométrico de dos escalas de autoeficacia e intereses profesionales en una muestra de estudiantes de secundaria. CES Psicología, 8(2), 156-170.). Cuando este supuesto no se cumplió, se realizaron ajustes con los métodos de Greenhouse & Geisser (1959)Greenhouse, S. W., & Geisser, S. (1959). On methods in the analysis of profile data. Psychometrika, 24(2), 95-112. y de Huynh & Feldt (1976)Huynh, H., & Feldt, L. S. (1976). Estimation of the Box Correction for Degrees of Freedom from Sample Data in Randomized Block and Split-Plot Designs. Journal of Educational Statistics, 1(1), 69-82. https://doi.org/10.3102/10769986001001069 .

Para optimizar la estimación de los parámetros del modelo, se compararon distintas estructuras de varianza-covarianza: no estructurada (UN), Toeplitz (TOEP), autorregresiva de primer orden (AR(1)), simetría compuesta (CS) y componentes de varianza (CV). La selección de la estructura más adecuada se basó en los criterios de información de Akaike (AIC), Akaike corregido (AICC) y Bayesiano (BIC).

Se utilizaron modelos lineales generalizados mixtos (GLMM), cuya expresión fue:

Donde:

y_ijk = variable respuesta (altura y diámetro de la planta)

μ= media común o intercepto

α_i = efecto fijo del i-ésimo tratamiento (tipos de siembra in vitro y natural (i=1, 2)

β_j = efecto fijo del j-ésimo mes (j= 1,........,4)

b_k = efecto aleatorio de la k-ésima unidad experimental planta (k= 1,.....,n)

e_ijk= error aleatorio asociado a todas las observaciones

La estimación de parámetros se realizó mediante el método de Máxima Verosimilitud Restringida (REML). Para la comparación de medias se aplicó la dócima de Bonferroni (1936)Bonferroni, C. (1936). Teoria statistica delle classi e calcolo delle probabilita. Pubblicazioni del R istituto superiore di scienze economiche e commericiali di firenze, 8, 3-62., con un nivel de significancia establecido en p < 0,05. El ajuste de los modelos se llevó a cabo mediante la aproximación de Laplace, incluida en el procedimiento GLIMMIX del software SAS (Gualdrón, 2009Gualdrón, J. C. (2009). Influencia de los criterios de selección AIC Y BIC para la selección del modelo de evolución y la reconstrucción del análisis bayesiano. Available: Available:http://tux.uis.edu.co/labsist/docencia/finales/final2009-I/2050158-20070.pdf.[Consulted: June 20, 2018].; Vallejo et al., 2014Vallejo, G., Tuero-Herrero, E., Núñez, J. C., & Rosário, P. (2014). Performance evaluation of recent information criteria for selecting multilevel models in behavioral and social sciences. International Journal of Clinical and Health Psychology, 14(1), 48-57.).

El procesamiento estadístico se ejecutó con los siguientes paquetes informáticos: SAS versión 9.3 (SAS, 2013SAS. (2013). Sistema de análisis estadístico. Universidad de Nebraska USA.), IBM SPSS Statistics versión 26 (2019)Field, A. (2024). Discovering statistics using IBM SPSS statistics. Sage publications limited. e InfoStat versión 0.1 (2012). Estos programas permitieron realizar los análisis con precisión y eficiencia. Cada uno de ellos se seleccionó por su capacidad para manejar los requerimientos específicos del estudio.

Comportamiento de las medias

Al analizar las medias por tratamiento para cada variable (Tabla 4), se determinó que las plantas propagadas in vitro tuvieron un desarrollo superior en comparación con las propagadas de forma convencional. Estos resultados concuerdan con investigaciones previas que reportan mejoras en el vigor y la calidad fisiológica de las plantas mediante técnicas de micropropagación (George et al., 2008George, E. F., Hall, M. A., & De Klerk, G.-J. (2008). Plant propagation by tissue culture 3rd Edition. The Netherland, The Back Ground Springer, 65-175.). La superioridad observada en este grupo se mantuvo durante todo el periodo de evaluación.

Para evaluar la relación entre las variables dentro de cada medición y por grupo, se utilizó el coeficiente de correlación de Spearman. Esta prueba no paramétrica resultó adecuada para el tipo de datos analizados. Los resultados permitieron identificar patrones de asociación entre las variables en estudio.

En la primera medición, se observó una asociación débil entre las variables. El diámetro y la altura mostraron la relación más notable en esta etapa inicial. Sin embargo, otras variables no presentaron una correlación significativa.

Durante la segunda medición, el nivel de dependencia entre las variables aumentó de manera significativa. En el grupo in vitro, se registró una asociación casi perfecta, mientras que en el grupo natural este incremento no fue evidente. Estos resultados indican diferencias en el comportamiento de las variables según el grupo analizado.

En la tercera medición, la tendencia al aumento en la asociación entre variables se mantuvo. La correlación fue más fuerte en el grupo in vitro en comparación con el grupo natural. Este patrón sugiere que, en etapas tempranas, cuando las plantas son más pequeñas, la asociación entre el crecimiento radial y longitudinal es menor, pero se fortalece a medida que las plantas crecen.

Los resultados detallados se presentan en las Tablas 5 a la 10, junto con sus respectivas descripciones. Estas tablas proporcionan información adicional sobre las correlaciones identificadas en cada medición. El análisis confirma la variabilidad en la relación entre las variables según el grupo y la etapa de crecimiento.

Según los resultados de la primera correlación (Tabla 5), se observa que la dependencia entre las variables es muy pobre. Entre todas, las que presentan mayor relación son el diámetro y el número de tallos. Esta asociación, aunque débil, destaca frente a las demás combinaciones de variables analizadas.

En la Tabla 6, los resultados reflejan que la primera correlación muestra una dependencia muy baja entre las variables. El número de tallos no presenta relación con las demás variables, ya que permanece constante en todas las mediciones. Este comportamiento contrasta con lo observado en las plantas propagadas in vitro, donde se detectan variaciones significativas.

En la segunda correlación (Tabla 7), el nivel de dependencia entre las variables aumenta de manera significativa. La asociación alcanza un nivel casi perfecto, lo que indica una fuerte relación entre los parámetros evaluados. Este cambio sugiere un patrón de comportamiento distinto al registrado previamente.

En este caso (Tabla 8), el nivel de asociación de las variables aumentó, aunque no alcanzó la misma intensidad que en las plantas del grupo in vitro. La dependencia observada fue menor, lo que refleja diferencias en la dinámica de crecimiento entre ambos grupos. Estos resultados permiten establecer comparaciones más precisas entre las condiciones experimentales.

La Tabla 9 muestra que el nivel de relación entre las variables del grupo in vitro continuó en aumento. La asociación alcanzó un nivel casi perfecto, lo que confirma la consistencia en el comportamiento de estas plantas. Este incremento refuerza la hipótesis de un desarrollo altamente coordinado en condiciones controladas.

De manera similar al grupo in vitro, la relación entre las variables del grupo natural también aumentó (Tabla 10). Sin embargo, esta incrementó en menor cuantía, lo que indica una asociación menos intensa en comparación. Estos hallazgos resaltan las diferencias en los patrones de crecimiento entre ambos grupos.

Prueba de Kruskal-Wallis para muestras independientes

Dado que se compararon dos grupos en varios momentos y no se cumplió el supuesto de normalidad, se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis para muestras independientes. Esta prueba permitió comparar los tres tiempos de medición dentro de cada grupo (Gibbons & Chakraborti, 2014Gibbons, J. D., & Chakraborti, S. (2014). Nonparametric statistical inference: Revised and expanded. CRC press. https://api.taylorfrancis.com/content/books/mono/download?identifierName=doi&identifierValue=10.4324/9780203911563&type=googlepdf ). Los resultados mostraron variaciones significativas en algunos de los periodos evaluados.

En la Figura 1 se observa que los rangos de las mediciones varían entre los grupos. Sin embargo, las medias de los valores para la altura son similares en ambos grupos, lo que indica que la diferencia no es estadísticamente significativa. Este patrón contrasta con los resultados obtenidos en otras variables.

La Figura 2 presenta el comportamiento de los valores de diámetro en el primer periodo. Los rangos de las mediciones y las medias difieren entre los grupos, lo que sugiere la presencia de diferencias significativas. Este hallazgo marca un contraste con los resultados de la altura en el mismo periodo.

La Figura 3 muestra los valores de altura en el segundo periodo de medición. A diferencia del comportamiento inicial, los rangos y las medias varían notablemente entre los grupos, lo que indica la aparición de diferencias significativas en esta fase. Este cambio sugiere una evolución en la variable a lo largo del tiempo.

En la Figura 4 se presenta el comportamiento del diámetro en el segundo periodo. Los rangos y las medias continúan mostrando variaciones entre los grupos, lo que confirma que persisten las diferencias significativas. Estos resultados refuerzan la tendencia observada en la primera medición.

La Figura 5 ilustra los valores de altura en el tercer periodo. Los rangos y las medias siguen variando entre los grupos, lo que demuestra que las diferencias significativas se mantienen. Este patrón coincide con lo observado en el segundo periodo.

Finalmente, la Figura 6 muestra los valores de diámetro en el tercer periodo. Los rangos y las medias presentan variaciones entre los grupos, lo que indica que las diferencias significativas persisten. Estos resultados consolidan las tendencias identificadas en las mediciones anteriores.

En la Tabla 11 se muestra un resumen de contrastes de hipótesis. En la primera medición (T1) no se observaron diferencias significativas entre los grupos en cuanto a la altura. Sin embargo, en la segunda (T2) y tercera medición (T3) sí se detectaron variaciones estadísticamente relevantes. Respecto al diámetro, las diferencias significativas aparecieron desde la primera evaluación y persistieron durante todo el experimento.

Las gráficas (Figuras 1-6) evidencian que los rangos de medición y las medias varían entre los grupos, especialmente a partir de la segunda medición. Estos datos confirman que las plantas cultivadas in vitro presentaron un mejor desempeño en términos de crecimiento en altura y diámetro. Además, la diferencia entre los grupos se incrementó conforme avanzó el estudio.

Análisis de supervivencia

Se llevó a cabo un conteo total de plantas en campo, clasificándolas según su método de propagación (in vitro vs. convencional). De un total de 498 plantas (467 convencionales y 31 in vitro), sobrevivieron 309 plantas convencionales y 25 plantas in vitro, lo que corresponde a tasas de supervivencia del 66% y 81%, respectivamente. En la Figura 7, los espacios marcados con una (X) indican las plantas que no lograron sobrevivir en ambos grupos.

Estos hallazgos indican que las plantas propagadas in vitro presentan una mayor resistencia a las condiciones ambientales del sitio. Esta ventaja podría atribuirse a una mejor calidad fisiológica adquirida durante el proceso de micropropagación (George et al., 2008George, E. F., Hall, M. A., & De Klerk, G.-J. (2008). Plant propagation by tissue culture 3rd Edition. The Netherland, The Back Ground Springer, 65-175.).